«Рост за пределы особи» Итак, перед нашими глазами прошли главные персонажи эффектного эволюционного спектакля, который вывел на сцену жизни множество совершенно удивительных существ. При всех тех различиях, которые придают бесспорное своеобразие каждой обширной

Рост и размножение микроорганизмов Как сказал известный французский физиолог XIX века Клод Бернар, жизнь есть творение. Живые организмы отличаются от неживой природы главным образом тем, что растут и размножаются. Их рост и размножение лучше всего наблюдать у таких

Микробы ускоряют рост растений В различных органах растений образуются вещества, регулирующие и до известной степени ускоряющие их рост. К таким веществам относится, например, f3-индолилуксусная кислота (гетероауксин).Интересно, что гетероауксин вырабатывают и выделяют

«Роскошный рост» Escherichia coli обитала в организме наших предков на протяжении миллионов лет еще тогда, когда предки эти вовсе не были людьми. Но только в 1885 г. вид Homo sapiens и его жильцы были официально представлены друг другу. Немецкий педиатр по имени Теодор Эшерих занимался

1. Размножение - это рост, наследственность и развитие Размножение - одно из самых специфических и самых сложных свойств жизни. Это и естественно, так как в эволюции отбор идет именно на эту способность: в борьбе за существование побеждают те организмы, которые

Для микроорганизмов, как и для других живых существ, характерны рост и размножение. Под ростом клетки подразумевают согласованное увеличение количества всех химических компонентов (например, белка, РНК, ДНК), ведущее, в конечном счете, к возрастанию размеров и массы клетки. Рост микробной клетки не безграничен, достигнув определенной величины, клетка прекращает рост и начинает размножаться.

Размножение - это увеличение числа клеток микроорганизмов в Популяции. Микроорганизмы размножаются или путем поперечного деления, происходящего в процессе роста, или почкованием (которое встречается исключительно редко), или путем образования спор.

Прокариоты обычно размножаются бесполым путем - бинарным делением. В начале деления клетка удлиняется, затем делится нуклеоид. Воспроизведение нуклеоида, содержащего всю генетическую информацию, необходимую для жизнедеятельности микроорганизма,- наиболее важный из всех процессов, которые происходят при росте клетки.

Нуклеоид представлен суперспирализованной и весьма плотно уложенной молекулой ДНК, которая является самореплицирующейся структурой и известна под названием репликона. К репликонам относятся также плазмиды - генетические структуры, способные к самостоятельной репликации. Репликация ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. Этот процесс начинается в определенной точке ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Закапчивается репликация также в определенном месте ДНК - В результате репликации число молекул ДНК в клетке удваивается. Вновь синтезированные молекулы ДНК постепенно расходятся в образующиеся дочерние клетки. Все это позволяет дочерней клетке иметь совершенно тождественную материнской клетке по последовательности нуклеотидов молекулу ДНК - Считают, что репликация ДИК, занимает почти 80% времени, в течение которого осуществляется деление бактериальной клетки.

После завершения репликации ДНК начинается сложный комплекс процессов, которые ведут к образованию межклеточной перегородки. Вначале с обеих сторон клетки происходит врастание двух слоев цитоплазматической мембраны, а затем между ними синтезируется пептидогликан и образуется перегородка, состоящая из двух слоев цитоплазматической мембраны и пептидогликана.

Во время репликации ДНК и образования делящей перегородки клетка микроорганизма непрерывно растет. В этот период происходят синтез пептидогликана клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, образование новых рибосом и других органелл и соединений, которые входят в состав цитоплазмы. На последней стадии деления дочерние клетки отделяются друг от друга. Процесс деления у некоторых бактерий идет не до конца, в результате образуются цепочки клеток.

При делении палочковидных бактерий клетки вначале растут в длину (диаметр клетки не меняется). Когда длина бактерии удваивается, палочка несколько сужается в середине и затем распадается на две клетки. Чаще всего клетка делится на две равные части (изоморфное деление), однако встречается и неравномерное (гетероморфное) деление, когда дочерняя клетка больше материнской.

На рисунке 25 показано деление бактерии со жгутиками. Только у материнской клетки остаются жгутики. Дочерняя клетка не имеет жгутиков: они вырастают позднее. При многочисленных исследованиях жгутики обычно находили только у одной клетки из недавно разделенной пары. Можно полагать, что материнская клетка сохраняет главную часть первоначальной клеточной стенки, фибрии и жгутики.

Спирохеты, риккетсии, некоторые дрожжи и грибы, простейшие и другие организмы размножаются поперечным делением клеток.

Миксобактерии делятся перетяжкой. Сначала клетка в месте деления слегка суживается, далее клеточная стенка, постепенно впячиваясь с обеих сторон внутрь клетки, все больше и больше сужает ее и, наконец, делит на две. Дочерняя клетка, одетая уже собственной цитоплазматической мембраной, еще временно сохраняет общую клеточную стенку.

У бактерий иногда наблюдается «половой» процесс, или конъюгация (см. главу 4).

В результате роста и размножения клетки микроорганизма образуется колония микробов - потомков.

Микроорганизмы отличаются высоким темпом размножения, выражающимся временем генерации, то есть временем, в течение которого происходит деление клетки. Время генерации определяется видом микроорганизма, его возрастом и внешними условиями (составом питательной среды, температурой, pH и другими факторами).

При благоприятных условиях время генерации многих микроорганизмов колеблется от 20 до 30 мин. При такой скорости роста можно получить 6 генераций за 2 ч (для получения стольких же поколений у человека требуется 120 лет). Благодаря способности бактерий к быстрому размножению, в природе наблюдается их численный перевес над другими живыми организмами. Однако бактерии не могут очень долго продолжать расти с периодом генерации 20 мин. Если бы такой рост был возможен, то одна - единственная клетка кишечной палочки (Escherichia coli) через 24 ч образовала бы 272, или около 1022 потомков, общая масса которых составила бы несколько десятков тысяч тонн, а еще через 24 ч роста этой бактерии масса ее потомков превысила бы в несколько раз массу земного шара. Недостаток пищи, и накопление продуктов распада ограничивают такое бурное размножение бактерий. В проточной среде бактерии могут делиться через каждые 15-18 мин.

Наблюдения за ростом микроорганизмов, культивируемых на жидкой среде в замкнутых резервуарах, показывают, что скорость, их роста изменяется во времени. Внесенные в питательную среду микроорганизмы вначале не развиваются, они «привыкают» к условиям среды. Затем начинается их размножение с все возрастающей скоростью, достигающей максимума, на который они способны в данной среде. По мере исчерпания питательных веществ и накопления продуктов обмена рост замедляется, а затем полностью прекращается. Цикл развития бактерий состоит из нескольких фаз (рис. 26).

I. Исходная (стационарная) фаза начинается после внесения, микроорганизмов в питательную среду и продолжается от 1 до 2 ч. Во время этой фазы количество бактерий не увеличивается, и клетки не растут.

II. Лаг - фаза - период задержки размножения. В это время бактерии, внесенные в свежую питательную среду, начинают интенсивно расти, но скорость их деления остается невысокой.

Две первые фазы развития бактериальной популяции называют периодом приспособления к новой среде. К концу лаг – фазы клетки часто увеличивают свой объем. Длительность лаг – фазы зависит как от внешних условий, так и от возраста бактерий и их видовой специфичности.

III. Фаза интенсивного логарифмического, или экспоненциального, размножения. В этот период размножение бактерий идет с наибольшей скоростью, и число клеток увеличивается в геометрической прогрессии.

IV. В фазе отрицательного ускорения клетки бактерий становятся менее активными, и период генерации начинает удлиняться. Одна из причин, замедляющих размножение бактерий,- истощение питательной среды и накопление в ней ядовитых (токсических) продуктов обмена. Это замедляет ритм размножения. Некоторые клетки перестают размножаться и погибают.

V. Стационарная фаза - период, когда число вновь возникающих клеток примерно равно числу отмирающих. Поэтому количество живых клеток некоторое время остается практически неизменным. Однако при этом общая численность живых и мертвых бактерий несколько увеличивается, хотя и не так быстро. Эта фаза иногда называется «максимальной стационарной», так как при ней численность клеток в среде достигает максимума.

VI-VIII. Фазы отмирания характеризуются тем, что отмирание клеток преобладает над размножением. Во время прохождения VI фазы увеличивается число отмерших клеток. На смену этой фазе приходит VII - логарифмической гибели клеток, когда они отмирают с постоянной скоростью. Наконец, наступает VIII фаза, в которой скорость отмирания клеток бактерий постепенно уменьшается. Отмирание клеток бактериальной популяции в последние три фазы связано с изменением физико - химических свойств питательной среды в неблагоприятную для бактерий сторону и с другими причинами. Ритм гибели клеток в эти фазы становится быстрым, и число живых клеток все более снижается, до тех пор, пока они почти полностью не отмирают.

При описанном выше культивировании в замкнутом резервуаре микроорганизмы все время находятся в меняющихся условиях, это так называемая непроточная культура микроорганизмов. Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток в питании и отравление продуктами обмена. Все это приводит к снижению скорости роста, в результате чего культура переходит в стационарную фазу. Однако если добавлять в среду питательные вещества и одновременно удалять продукты обмена, то микроорганизмы могли бы пребывать в течение неопределенного времени в экспоненциальной фазе роста. Такой способ положен в основу проточного культивирования микроорганизмов, осуществляемого в хемостатах и турбидостатах с помощью специальных устройств для непрерывной подачи среды с регулируемой скоростью и для хорошего ее перемешивания.

Следовательно, в отличие от непроточной при проточной культуре для микроорганизмов создаются неизменные условия. Поэтому можно поддерживать непрерывный и постоянный прирост клеток при любой скорости роста культуры. Проточное культивирование микроорганизмов поддается автоматическому регулированию, оно весьма перспективно и широко внедряется в промышленность и лабораторную практику.

В физиологических исследованиях микроорганизмов важным является получение так называемых синхронных культур. Синхронной культурой называют бактериальную культуру (или популяцию), в которой все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла. Синхронные культуры обычно используют для изучения отдельных бактерий в процессе их роста.

Кривая роста характеризует рост и размножение бактерий в определенных условиях среды. Кривую роста получают при изучении периодической культуры.

Периодическая культура это популяция микроорганизмов которая развивается в ограниченном объеме среды без поступления питательны веществ.

1 фаза - начальная - бактерии растут но не размножаются

2 фаза - фаза lg роста - бактерии интенсивно размножаются

3 фаза - стационарная - размножение - равно смертности

4 фаза - отмирания - накапливаются продукты метаболизмы, истощается питательная среда, бактерии погибают.

Внешние факторы могут оказывать

• Бактериостатическое действие - подавлять размножение и рост бактерий
• Бактерицидное действие - вызывать гибель бактерий

Ферменты бактерий

- Энзимы - специфические белки, которые катализируют химические реакции. Ферменты, вызывают перераспределение электронных плотностей и некоторую деформацию молекулы субстрата. Это приводит к ослаблению внутримолекулярных связей, снижается энергия активации и ускоряется реакция.

Классификация ферментов -

1. По типу катализируемой реакции - оксиредуктазы, лиазы, трасферазы, гидролазы и тд.
2. По локализации - эндоферменты - катализируют реакции внутри клетки. Экзоферменты - выделяются из бактериальной клетки, катализируют расщепление
3. Генетический контроль образования - конститутивные(в течении всего жизненного цикла, не влияет наличие субстрата), индуцибильные - они образуются в ответ на наличие субстрата
4. По субстрату - протеолитические - расщепляют белки, сахаролитические - расщепляют углеводы, липолитические - расщепляющие жиры.

Значение ферментов.

1. Синтез ферментов детерминирован, поэтому определение ферментативных свойств служит для идентификации организмов

2. Ферменты бактерии определяют их болезнетворность

3. Ферментативные свойства используются в микробиологической промышленности

Определение бактериальных ферментов

Протеазы расщепляют белки до аминокислот, мочевины, индола, сероводорода, аммиака. На средах с белком по выделению этих продуктов выявляют протеазы. Используют желатин, разжижение среды. На свернутой сыворотке по ее разжижению и на молоке по его просветлению. Казеин - будет разрушаться, белок свертываться. На МПБ по выделению газа индола и сероводорода, которые выявляют с помощью индикаторных бумажек

Определение ферментов, расщепляющих углеводы - сахаролитические. Эти ферменты расщепляют углеводы до альдегидов, кислот, углекислого газа, и H2. Для их определения используют МПБ или МПА, добавляют индикатор кислотообрзазованияи + углевод + поплавок для газообразования. ПО такому принципу создают среды Гиса и Пестреля. Если свет среды меняется, выделяется газ, значит идет расщепление углеводов. Используют моносахара. На этом принципе создаются панели, планшеты, бумажные индикаторные системы, СИБ - системы индикаторных бумажек, энетротуба и приборы для учета ферментативной активности.(образуется угольная кислота => нужны индикаторы с Ph)

Липолитические ферменты - липазы - выявляют на ЖСА - желточно солевой агар, который содержит желток, в котором много липидов и разрушение липидов сопровождается просветлением среды

Культивирование микроорганизмов.

Это получение большого числа бактерий на питательной среде. Цели культивирования. Культивирования проводят для

1. Изучение микробиологических свойств

2. Для диагностики инфекций

3. Для получения биопрепарата - из бактерий или полученные с помощью бактерий.

Такими препаратами могут быть лечебными, диагностическими, профилактические. Условия культивирования бактерии -

1. Наличие полноценной питательной среды.
2. Оптимальная температура
3. Атмосфера культивирования - либо кислород, либо его отсутствие.
4. Время культивирования - видимый рост через 18-48 часов, но некоторые - туберкулез например - 3-4- недели
5. Освещенность Некоторые будут расти только в присутствии света.

Способы культивирования аэробов

1. Стационарный - на поверхности агара
2. Метод глубинно культивирования с аэрацией среды. Аэрацию проводят для растворения кислорода в среде.
3. Непрерывное культивирование - используют проточные питательные среды.

Культуральные свойства микроорганизмов. Это особенности роста бактерий на питательных средах.

На жидких питательных средах бактерий вызывают помутнение среды, могут образовывать осадок - придонный, пристеночный и могут образовывать пленку на поверхности среды. НА плотных питательных средах образуются колонии.

Колония - изолированное скопление микроорганизмов одного вида на плотной питательной среде. Имеет определенную величину, поверхность, край, форму, консистенцию, структуру, цвет.

Типы колоний

S-гладкие - круглая форма, ровные края, гладкая поверхность.

R-колонии - шероховатые, неровные края, исчерченная поверхность

SR колонии 0 промежуточные - слегка неровные края и поверхность.

Особенности культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробов создаются безкислородные условия. Это достигается

1. Регенерацией питательной среды - питательная среда кипятится и растворенный кислород выходит из среды.
2. использование специальных приборов - анаэростаты и эксикаторы. В них кислород поглощается либо химическими поглотителями, либо откачивается от прибора.
3. Добавление в среду редуцирующих веществ - веществ, которые легко и быстро окисляются - углеводы, цистеин, кусочки паренхиматозных органов, аскорбиновая кислота. НА этом принципе создана среда для анаэробов - Кит-Тароцци - среда для анаэробов. Она содержит МПБ, углевод и кусочки печени, которые содержат цистеин.
4. Специальные методы посева. Посев под масло, посев в трубке Вейон- Веньяна, посев по Фортнеру. На чашку заселяют Аэробы и анаэробы - Аэробы поглощают кислород и получается анаэробная среда.

Выделение чистых культур.

Чистая культура - популяция микроорганизмов одного вида, выделенная на жидкой или плотной питательной среде в большом количестве.

Цели выделения.

1. Диагностика инфекций. Выделение чистых культур - основа бактериологического метода. Основан на выделение чистой культуры и ее идентификации. Идентификация - определение вида.
2. Получение биопрепаратов
3. Изучение биологических свойств бактерий
4. Санитарно-гигиеническое исследование

Этапы выделения чистой культуры аэробов.

1. Изучение смеси - мазок окраска по Грамму.
2. Разобщение смеси и получение колоний. Разобщение проводят 1) По Дригальскому - штрихами по поверхности агара. Петлей берут материал и засевают по агару. Посев Шпателя на несколько Чашек. 2)Метод серийных разведений. 3) Коха - метод серийных разведений в расплавленном агаре.
3. Проверка частоты колоний, мазок, окраска по грамму
4. Пересев материала из колоний на скошенный агар для накопления чистой культуры. Выделенная чистая культура идентифицируется по свойствам - морфологическим, тинкториальным, культуральным, ферментативным, и другим.

Выделение чистой культуры анаэробов

1. Накопление анаэробов. Смесь засевают на среду Киттароци и прогревают при температуре 80 градусов 10 минут. Анаэробы, образующие споры сохраняются, а другие - вегетативные формы погибают. Затем питательная среда культивируется, споры прорастают, и накапливаются

2. Получение колоний по Цейслеру колонию анаэробов получают на поверхности агара в Анаэростате, по Вейнбергу, колонии получают в трубках Вейон-Виньяля.

3. Проверка частоты колоний - мазок, окраска по Грамму

4. Пересев Колоний на среду Киттароци, накопление анаэробом, чистой культуры.

5. Идентификация, определение вида анаэроба.

Другие способы выделения чистых культур.

1. Можно использовать оптимальные температуры
2. Выделение спор при прогревании смеси 10 минут при 80 градусах
3. Использование феномена роения - распространение за территорию посева.
4. Метод Шукевича - выделение чистой культуры микроорганизмов, обладающих ползучим ростом.
5. Фильтруемость бактерий - способность проходить через фильтры с определенной величиной спор. Обработка смеси ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком, антисыворотками, получение чистой культуры, устойчивых к этим факторам микроорганизмов.
6. При электрофорезе смеси. У анода или катода будут скапливать организмы с определенным зарядом.
7. Использовать микроманипулятор. Под микроскопом взять клетку и получить чистую культуры - клон - потомство одной микробной клетки. Использование элективных питательных сред.
8. В питательные среды добавляют желчь, соли тиурита, натрийхлор, антибиотики, и выделяют чистую культуру устойчивых микроорганизмов.
9. Можно использовать дифференциально-диагностические среды.
10. Можно использовать биологический метод. Внутрибрюшинно заражают смесью бактерий белых мышей и за счет тропизма, бактерии накапливаются в определенном органе.

Пигменты бактерий.

Это красящие вещества, выделяемые бактериальной клеткой, их синтез генетически детерминирован. По химической структуре пигменты могут быть каратиноидами - красно-желтые, пирролы - зеленые, фенозиновые красители - сине-зеленые и меланиновые - черные ферменты.

Желтые - золотистый стафилакок, сине-зеленый - синегнойная палочка

Пигменты делятся на

1. Нерастворимые пигменты - окрашивают только колонии
2. Растворимые пигменты - могут быть растворимы в спиртах, воде

Пигменты образуются как правило у бактерий, которые находятся в воздушной микрофлоры, у антибиотико-резистентыных микроорганизмов, т.к. они вторичные метаболиты и пигменты часто образуются на свету.

Функция пигментов

1. Пигменты участвуют в обмене веществ
2. Повышают резистентность к антибиотикам
3. Повышают устойчивость к УФ лучам за счет того, что защищают области чувствительные к фотоокислению

L -формы бактерий .

Открыты в 1935г. Это микроорганизмы, лишенные клеточной стенки, но сохранившие способность расти и размножаться. L формы образуются у большинства гетеротрофов и грибов. Факторы, индуцирующие L трансформацию -

1. Антибиотики

2. Аминокислоты - глицин, метионин, лейцин и некоторые другие.

3. Ферменты - лизоцим.

4. Факторы макрорганизма - макротела, комплимент

Эти факторы либо разрушают клеточную стенку, либо действовать на геном клетки и синтез компонентов клеточной стенки не происходит.

Свойства L форм.

1. L формы обеспечивают выживание бактерий при изменении условий среды.
2. Морфологически сходны у отдельных видов бактерий. Они полиморфны - шаровидные, грамотрицательные. Они образуют колонии типа А - мелкие колонии на поверхности среды и колонии типа Б - темный центр, и приподнятые края, колонии врастают в питательную среду.
3. Анаэробы или микроаэрофилы
4. L-формы имеют много способов размножения - бинарное деление, почкование, фрагментация, комбинированное.
5. Они обладают сниженной вирулентностью, у них нет адгезии и у них измененные антигенные свойства.
6. Они способны реверсировать - возвращаться в исходную бактериальную форму

И вызывать трудно поддающиеся лечению инфекции.

Это обусловлено тем, что L - формы, устойчивы к антибиотикам и они устойчивы к защитным факторам макроорганизма, к антителам, фагоцитозу, комплименту.

Некультивируемые формы бактерий НФБ

Это бактерии, которые имеют метаболическую активность, но не растут на питательных средах, переход в некультивируемую форму может наблюдаться у многих микроорганизмов, при воздействии неблагоприятных условий. Этот переход контролируется генетически. Переход осуществляется под действием факторов

1. Температура, особенно низкая
2. Концентрация солей
3. Аэрация среды
4. Количество питательных веществ

Значение некультивированных форм. В такой форме они сохраняются в о внешней среде между эпидемиями и при попадании в макроорганизм могут рекультивроваться - оживляться - это объясняет наличие природно очаговых заболеваний.

Выявление -

1. Прямой подсчет числа клеток

2. Выявление активности ДНК

3. Генетические методы исследования.

Рост и размножение бактерий

Рост бактерий происходит в результате множества взаимосвязанных биохимических реакций, осуществляющих синтез клеточного материала, что приводит к увеличению количества всех химических компонентов. У бактерий различают индивидуальный рост бактериальной клетки и рост бактерий в популяции.

Индивидуальный рост бактерий . О нем судят по увеличению размеров отдельных особей. Скорость роста зависит от внешних условий и физиологического состояния самой клетки. При постоянных условиях рост осуществляется с постоянной скоростью. Палочковидные бактерии растут преимущественно в направлении длинной оси, поэтому соотношение между поверхностью клетки и ее объемом при росте клеток существенно не изменяется, и это создает постоянные условия снабжения каждой части клетки питательными веществами и кислородом. Кокки растут равномерно во всех направлениях, увеличивая размеры радиуса клетки, при этом относительная величина поверхности клетки падает, поэтому условия снабжения каждой части клетки становятся все более неблагоприятными. В промежутках между клеточными делениями бактерии имеют большие размеры, чем сразу после деления.

Размножение бактерий. Наиболее часто бактерии размножаются путем бинарного деления, когда из одной клетки образуется две, каждая из которых вновь делится. Процессу деления всегда предшествует репликация ДНК. Существует два типа деления – деление перетяжкой (перешнуровывание) и с помощью поперечной перегородки (рисунок 1.9).

Рисунок 1.9 – Деление бактерий

А - деление перетяжкой; Б - деление поперечной перегородкой; КС – клеточная стенка; ЦМ – цитоплазматическая мембрана; Н – нуклеоид; П – перетяжка

Деление перетяжкой (констрикция) сопровождается сужением клетки в месте ее деления, и в этом процессе принимают участие все слои клеточных оболочек. Выпячивание оболочек с обеих сторон внутрь клетки все более ее сужает и, наконец, делит на две. Так делятся многие грамотрицательным бактериям.

Деление с образованием поперечной перегородки присуще грамположительным бактериям. Однако у некоторых групп бактерий отмечена смена способов деления (тионовые бактерии, микобактерии). У шаровидных бактерий может образовываться несколько поперечных перегородок (тетракокки, сарцины).

Период от деления до деления называется клеточным циклом (онтогенез бактерий). Различают несколько типов вегетативного клеточного цикла: мономорфный – образуется только один морфологический тип клеток (например, бациллы), диморфный – два морфологических типа, полиморфный – несколько, каждый из которых характеризуется определенными и постоянными особенностями клеточного цикла (например, актиномицеты). При диморфном и полиморфном циклах различают дочерние и материнские клетки.

Почкование убактерий является разновидностью бинарного деления. Этот способ размножения присущ бактериям, имеющим диморфные или полиморфные клеточные циклы. Почкующимся бактериям присуща полярность клеток. Некоторые бактерии размножаются с помощью экзоспор (но не эндоспор!), фрагментами гиф (актиномицеты). Есть бактерии, у которых имеются половые ворсинки, или F-пили (англ. fertility –фертильность, плодовитость), обусловленные наличием полового фактора.

Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Например, при благоприятных условиях кишечная палочка делится каждые 20…30 мин, за сутки из одной клетки проучится 2 72 (72 поколения). В условиях, исключающих гибель, такая биомасса составит 4720 т. Скорость размножения зависит от факторов внешней среды (температура, условия питания, влажность, реакция среды и др.) и от видовых особенностей бактерий. Высокая скорость размножения бактерий обеспечивает их сохранение на Земле даже в условиях массовой гибели. Сохранившиеся отдельные клетки размножаются и вновь дают поколение.

Рост бактерий в популяции. Популяция (фр. population – население) – это совокупность бактерий одного вида (чистая культура) или разных видов (смешанная ассоциация), развивающихся в ограниченном пространстве (например, в питательной среде). В бактериальной популяции постоянно происходит рост, размножение и отмирание клеток. Культивирование микроорганизмов в искусственных условиях бывает периодическим, непрерывным и синхронным.

Периодическое (стационарное) культивирование . Это культивирование происходит без притока и оттока питательной среды. Оно характеризуется классической кривой роста микроорганизмов, в которой выделяют отдельные фазы роста бактериальной популяции, отражающие общую закономерность роста и размножения клеток (рисунок 1.10).

Рисунок 1.10 – Кривая роста и развития бактериальной популяции

Лаг-фаза (англ. lag – отставание) начинается с момента посева бактерий в свежую питательную среду. Клетки адаптируются к данным условиям культивирования, растут, но не размножаются, они достигают максимальной скорости роста. Абсолютная и удельная скорость роста увеличиваются от нуля до максимально возможных значений.

Абсолютная скорость роста определяется отношением:

V = dx/dt, (1.1)

где V – прирост биомассы или числа клеток;.

х – биомасса или число клеток,

t – время.

Удельная скорость роста определяется по формуле:

µ = (dx/dt) ∙ 1/х, (1.2)

где µ - прирост биомассы е единицу времени на единицу биомассы,

х – начальная биомасса.

Продолжительность лаг-фазы зависит от биологических особенностей бактерий, возраста культуры, количества посевного материала, состава питательной среды, температуры, аэрации, рН и др. Одни бактерии обладают коротким периодом задержки роста, другие длинным. Чем моложе культура, тем период короче. Чем состав питательной среды ближе к тому, в котором выращивали микроорганизмы, тем короче лаг-фаза. Изменения в питательной среде приводят к изменению лаг-фазы, так как необходимо время для синтеза ферментов, либо повышения их активности. Таким образом, факторы задержки роста можно разделить на внешние (состав среды, рН, температура и др.) и внутренние (возраст культуры). Длительность фазы моет быть от нескольких минут до нескольких часов и даже дней. В этой фазе μ = 0.

Логарифмическая , или экспоненциальная , или лог-фаза , характеризуется максимальной скоростью деления бактерий. Экспоненциальный рост популяции описывается уравнением:

Х = Х о ∙ е μ max ∙ t , (1.3)

где Хи Х о - количество клеток (или биомасса) в конце и в начале опыта;

t– время опыта;

е– основание натурального логарифма;

μ max – максимальная удельная скорость роста.

В период логарифмической фазы большинство клеток является физиологически молодыми, биохимически активными, а также наиболее чувствительными к неблагоприятным факторам внешней среды. В этой фазе μ = max.Эта фаза многостадийна, так как в начале ее бактерии растут в среде с избытком субстрата, затем концентрация его понижается, изменяется активность ферментов, возрастает содержание клеточных метаболитов. Кроме того, на рост бактерий оказывают влияние многие факторы: видовые особенности бактерий, характер питательной среды и концентрация ее отдельных компонентов, температура культивирования.

Фаза замедленного роста . Она объединяет две фазы – фазу линейного роста (μ = const) и фазу отрицательного ускорения . Фаза характеризуется в период линейного роста постоянной скоростью прироста биомассы (числа клеток). Затем при переходе в фазу отрицательного ускорения численность делящихся клеток уменьшается. Наступление фазы объясняется количественными изменениями состава питательной среды (потребление питательных веществ, накопление продуктов метаболизма).

Стационарная фаза характеризуется равновесием между погибающими и вновь образующимися клетками. Факторы, лимитирующие рост бактерий в предыдущей фазе, являются причиной возникновения стационарной фазы. Прироста биомассы нет (μ = 0).В этой фазе наблюдается максимальная величина биомассы и максимальная суммарная численность клеток. Эти максимальные величины называются урожаем , или выходом . Одним из ограничивающих факторов является максимальная концентрация клеток в единице объема питательной среды. У разных видов бактерий эта величина значительно варьирует. В стационарной фазе клетки характеризуются несбалансированным ростом (клеточные компоненты синтезируются с различной скоростью), уменьшением интенсивности обменных процессов, более высокой устойчивостью к физическим и химическим воздействиям.

Фаза отмирания (экспоненциальной гибели клеток ) характеризуется уменьшением числа живых клеток, возрастанием гетерогенности популяции (появляются клетки, не воспринимающие краситель, со слабым развитием муреинового слоя и др.). Процесс отмирания превалирует над делением (μ < 0).

Фаза выживания характеризуется наличием отдельных клеток, сохранивших в течение длительного времени жизнеспособность в условиях гибели большинства клеток популяции. Выжившие клетки характеризуются низкой активностью процессов метаболизма, изменением ультраструктуры клеток (мелкозернистая цитоплазма, отсутствие полирибосом и др.). Клетки более устойчивы к неблагоприятным условиям среды.

Таким образом, при стационарном культивировании микробные клетки все время находятся в изменяющихся условиях: сначала имеются в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает их недостаток, затем отравление клеток продуктами метаболизма.

Влияние лимитирующих факторов на скорость роста . Для нормального роста и развития микроорганизмов среда должна содержать необходимые элементы питания, иметь соответствующую рН, температуру и т.д. Факторы, ограничивающие рост культуры, называются лимитирующими . Характерная особенность роста популяции микроорганизмов – зависимость удельной скорости роста от концентрации субстрата. Эта зависимость выражается уравнением Моно , представляющим собой гиперболическую функцию:

μ = μ max ∙ S/(S + K S), (1.4)

где μ – удельная скорость роста;

μ max - максимальная удельная скорость роста;

S – концентрация субстрата;

K S - константанасыщения, численно равная такой концентрации субстрата, которая обеспечивает скорость роста, соответствующую половине значенияμ max .

По мере потребления питательных веществ среда обогащается продуктами обмена, которые также лимитируют рост культуры. Наиболее общий случай влияния концентрации субстрата и продуктов обмена на скорость роста популяции микроорганизмов нашел отражение в модели Н.Д.Иерусалимского:

μ = μ max ∙ S/(S + K S) ∙ К Р / (К Р / + Р), (1.5)

где Р – концентрация продуктов обмена;

К Р - константа, численно равная такой концентрации продуктов обмена, при которой скорость роста замедляется вдвое.

Анализ этого уравнения показывает, что при условии К Р >> Р, когда величиной Р можно пренебречь. скорость роста ограничена только концентрацией субстрата. Если S >> K S , то скорость роста лимитирована накоплением продуктов обмена

Непрерывное культивирование. Если в емкость, где находится бактериальная популяция, непрерывно подавать свежую питательную среду и одновременно с такой же скоростью выводить культуральную жидкость, содержащую бактериальные клетки и продукты метаболизма, то получается непрерывное культивирование. Регулируя скорость проточной среды, можно управлять ростом бактериальной популяции, например, удлинять логарифмическую или стационарную фазу на любое необходимое время. Непрерывное культивирование осуществляется в специальных приборах - хемостатах и турбидостатах.

Хемостаты . Рост бактерий регулируется концентрацией субстрата. Поддерживая постоянную концентрацию одного из необходимых субстратов (источник азота или углерода), путем регулирования скорости протока среды, можно сбалансировать скорость роста культуры. Скорость изменения величины биомассы клеток в хемостате равна разности между скоростью прироста биомассы и скоростью выноса ее из культиватора. Плотность популяции остается постоянной, если μ=D (удельная скорость роста равна коэффициенту разбавления), т.е. потеря клеток в результате вымывания и прирост их в результате размножения уравновешивается.

Турбидостаты .Принцип работы основан на регулировании скорости потока среды плотностью популяции. Плотность популяции контролируется фотоэлементом, соединенным с реле, регулирующим подачу среды. Когда плотность популяции достигает заданного уровня, реле срабатывает и в культиватор поступает свежая среде. В результате концентрация клеток уменьшается до определенного уровня и затем автоматически отключается подача среды.

Турбидостатный контроль может быть основан на других метолах определения биомассы, либо продуктов, образующихся в процессе роста бактерий (например, рН-статный способ управления скорости потока, использование оксистата– управление скоростью потока по скорости потребления кислорода и др.).

Непрерывное культивирование микроорганизмов используется для изучения их физиологии, биохимии, генетики и др., а также широко используется в микробиологической промышленности.

Синхронное культивирование. Синхронные культуры – это культуры, в которых некоторое время все клетки делятся одновременно (синхронно) за счет одинаковой готовности к делению всех особей. Синхронизация достигается физическими и химико-биологическими методами. Физические методы - это температурное воздействие, дифференциальное центрифугирование или дифференциальное фильтрование и др. Химико-биологические методы: вынужденное голодание бактерий, выращивание бактерий на неполноценных средах с последующим переносом их в полноценные среды. Синхронные культуры используются для генетических и цитологических исследований, для изучения синтеза отдельных клеточных компонентов в процессе деления бактерий.