Культивирование микроорганизмов. Общая микробиология

Для выделения чистой культуры микроорганизмов, изучения их биологических свойств с целью идентификации, а также для получения биомассы необходимо размножить микроорганизмы в условиях лаборатории. Культивирование, или выращивание, микробов возможно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Большинство бактерий, дрожжей, плесеней культивируют на искусственных питательных средах. Вирусы и риккетсии размножаются только в живых клетках, культуре тканей, курином эмбрионе или в организме животного.

Искусственные среды, применяемые для культивирования микроорганизмов, должны соответствовать определенным требованиям: быть легкоусвояемыми, с необходимым составом азотистых и углеводных веществ, витаминов, необходимой концентрацией солей, с определенным водородным показателем (рН среды); обладать буферными- свойствами; иметь оптимальный окислительно-восстановительный потенциал.

Питательные среды должны также содержать достаточное количество воды и обязательно быть стерильными, т. е. до посева не содержать микроорганизмов. Источником азота в средах могут быть различные органические, редко - неорганические соединения. Часто к безбелковым средам добавляют пептон, представляющий собой продукт неполного гидролиза белка. Протеолитические микроорганизмы в качестве азотистого вещества могут использовать желатин («животный студень»). Источником углерода в питательных средах чаще служат углеводы, спирты, некоторые органические кислоты.

Для приготовления искусственных питательных сред можно использовать различные естественные продукты: молоко, кровь, сыворотку, мясо, желток куриного яйца, картофель и другие органические вещества и минеральные соли.

Искусственные питательные среды по назначению подразделяют на четыре основные группы: универсальные, специальные, избирательные (элективные) и дифференциально-диагностические.

К универсальным средам относят мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, на которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. Специальные среды применяют для выращивания бактерий, не размножающихся на универсальных средах. К специальным относят среды с молоком, сывороткой крови, с добавлением крови животных, глюкозы и др. На них выращивают молочнокислые бактерии, патогенные и другие микроорганизмы.

В избирательных (элективных) средах хорошо развиваются только бактерии определенных видов. К таким средам относятся среды обогащения, в которых интересующий исследователя вид растет быстрее сопутствующих бактерий. Например, среда Кесслер, содержащая в своем составе генцианвиолет и желчь крупного рогатого скота, элективна для устойчивых к. этим веществам грамотрицательных кишечных палочек и вместе с тем селективна для чувствительных грамположительных бактерий.

Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся:

среды для определения протеолитической активности (мясопептонный желатин - МПЖ, молочный агар и др.);

среды для определения ферментации углеводов (среды Гисса, Эндо, Плоскирева и др.);

среды для определения гемолитической способности (кровяной агар и другие среды с добавлением крови животных);

среды для определения восстановительной (редуцирующей) способности микроорганизмов (среда Вильсон-Блера);

селективные среды, применяемые для дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, полужидкими и жидкими. Для получения сред плотной консистенции" к жидким средам добавляют 2-2,5 % агара или 10-20 % желатина. Полужидкие среды получают при добавлении 0,5- 1,0 % агара. Агар (по-малайски «желе») - плотное волокнистое вещество, получаемое из красных водорослей и образующее в водных растворах плотный гель (студень). Он состоит в основном из полисахаридов (70-75 %). Основными компонентами агара являются высокомолекулярные вещества агароза и агаропептин, которые не расщепляются и не усваиваются микроорганизмами. В связи с этим агар не является питательным субстратом, его добавляют в среды исключительно для получения плотной консистенции. Агар расплавляется в воде при 100 °С, а застывает при 40-43 °С. Его выпускают в виде желтоватых пластинок или серовато-белого порошка.

Осмотические условия, необходимые для жизнедеятельности микробов, создают в питательной среде добавлением хлорида натрия или определенным сочетанием солей фосфата натрия и фосфата калия.

Для жизнедеятельности микроорганизмов большое значение имеет реакция среды - водородный показатель (рН), который определяется соотношением водородных (Н +) и гидроксильных (ОН -) ионов. Он представляет собой логарифм числа абсолютной концентрации водородных ионов.

Водородный показатель нейтральной реакции соответствует 7,0. В этом случае число водородных ионов равно числу гидроксильных. Показатель ниже 7,0 указывает на кислую реакцию, а выше 7,0 - на щелочную. Микроорганизмы приспособились развиваться в условиях с чрезвычайно широким диапазоном рН - от 2,0 до 8,5. Большинство сапрофитных и патогенных микроорганизмов культивируют при слабощелочной реакции среды с рН 7,2-7,4. Для культивирования молочнокислых бактерий, дрожжей и плесеней необходима кислая реакция среды, рН 5,0-6,5.

В настоящее время многие питательные среды выпускают в виде готовых сухих сред-полуфабрикатов, содержащих все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов ингредиенты. Для приготовления питательной среды порошок разводят водой, полученную смесь кипятят, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют.

Большое значение для роста и размножения микроорганизмов на искусственных питательных средах имеют температурные условия. По отношению к температурному режиму все микроорганизмы делят на три группы: психрофильные (холодолюбивые), мезофильные (средние), термофильные (теплолюбивые). Температурные границы размножения у психрофилов составляют от 0 до 20 °С, у мезофилов - от 20 до 45 °С, у термофилов - от 45 до 70 °С.

При выращивании аэробов посевы культивируют в термостатах при доступе кислорода воздуха, т. е. в обычных условиях. Для культивирования анаэробов создают бескислородные условия, которые можно достичь физическими, химическими и биологическими методами. Используют также анаэробные термостаты.

Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах анаэростатах или в вакуум-эксикаторах, в которые сначала помещают посевы, а затем в аппаратах создают разрежение.

Иногда воздух в анаэростатах заменяют углекислым газом, азотом или другим инертным газом. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика питательного агара или внутри запаянных стеклянных трубок. Анаэробные условия можно создать и более простыми способами: с помощью слоя агара, залитого поверх посевов на плотной питательной среде, или с помощью вазелинового масла, которым покрывают жидкую питательную среду (среда Китта-Тароцци).

Химические методы заключаются в том, что в эксикатор с посевами помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в герметически закупоренных чашках Петри. При этом кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, после чего начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине.

ОБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ ПИГМЕНТОВ И АРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ. СВЕЧЕНИЕ МИКРОБОВ

Пигменты. Некоторые виды бактерий и грибов, обитающих в почве, воде и воздухе, способны вырабатывать красящие вещества, называемые пигментами.

Пигменты подразделяют на растворимые в воде, растворимые в спирте, нерастворимые в воде и спирте. Различают также хромопарные пигменты, которые поступают во внешнюю среду, и хромофорные пигменты, находящиеся в цитоплазме, вакуолях и оболочке.

Образование пигментов происходит при хорошем доступе кислорода, у большинства видов при рассеянном солнечном свете и оптимальной температуре 20-25 °С.

Микроорганизмы выделяют различные пигменты, цвет которых определяют по окраске колоний на плотной питательной среде, а иногда по цвету жидкой питательной среды. Растворимый в воде синий пигмент пиоцианин образует синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Пигмент вызывает порок молока, окрашивая его в синий цвет. Зеленый водорастворимый пигмент флюоресцин образуют флюоресцирующие палочки (Ps. fluorescens); красный, растворимый в спирте пигмент продигиозин продуцирует чудесная палочка (Serratia marcescens). Пигменты красного цвета могут выделять также актиномицеты и дрожжи, розовый пигмент - дрожжи и розовый микрококк. Стафилококки образуют пигменты золотистого, белого и желтого цветов. Колонии сарцин окрашиваются в желтый, лимонный или золотистый цвет. Плесневые грибы продуцируют преимущественно нерастворимые в воде и спирте пигменты черного, зеленого, бурого, шоколадно-коричневого цветов. Бурого цвета пигмент образуют некоторые штаммы спорообразующих гнилостных аэробов (грибовидная, капустная палочки).

При отсутствии благоприятных условий пигментобразующие микроорганизмы не продуцируют пигменты и образуют бесцветные (серовато-белые колонии).

Пигментообразование у микробов имеет определенное физиологическое значение. Пигменты обеспечивают защиту клеток от природной ультрафиолетовой радиации, участвуют в биохимических реакциях, обладают антибиотическим действием.

Ароматические вещества. Некоторые микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабатывают летучие ароматические вещества, сообщающие молочным продуктам (маслу, сыру) приятные специфические запах и вкус. Из этих веществ наибольшее значение имеют диацетил, летучие кислоты, этиловый спирт, уксусноэтиловый и уксусноамиловый эфиры и др.

Среди молочнокислых бактерий наиболее интенсивно выражено ароматообразование у гетероферментативных молочнокислых стрептококков Lactococcus diacetylactis, Leuconostoe cremoris, Leuconostoc dextranicum.

На интенсивность ароматообразования влияют температура сквашивания молока, реакция и окислительно-восстановительные условия среды. Оптимальными условиями ароматообразования для молочнокислых стрептококков являются: температура 23-25 °С; рН среды около 5,0; окислительно-восстановительный потенциал Eh 6; периодическое перемешивание закваски с целью обогащения ее кислородом.

Ароматические вещества при длительном хранении продукта разрушаются, особенно при высоких плюсовых температурах.

Свечение микроорганизмов. Свечение (люминесценция) представляет собой своеобразную форму освобождения энергии при окислительных процессах. Светящиеся микроорганизмы могут вызывать свечение различных пищевых продуктов (мяса, рыбы, сыра и т. д.). Они проникают в тело мелких ракообразных, обусловливая яркое свечение этих животных ночью у берега моря. У некоторых рыб светящиеся бактерии являются постоянными симбионтами (сожителями), служащими источником света. Светятся некоторые грибы, живущие в старых пнях и корнях деревьев.

Светящиеся бактерии называют фотобактериями. К ним относятся некоторые кокки, вибрионы, палочки, красящиеся по Граму отрицательно, не образующие спор.

Большая часть видов светящихся бактерий являются аэробами, они не вызывают гниения, растут на рыбных и мясных субстратах, культивируются в обычных средах. Оптимальная температура роста и свечения 15-18 °С, содержание хлорида натрия около 3 %. Типичным представителем фотогенных микробов является Fotobacterium phosphoreum - неподвижная кокковидная палочка, развивающаяся при 28 °С, при температуре выше 30 °С рост прекращается. Протеолитические свойства не выражены, желатин не разжижает.

Подавляется развитие фотогенных микробов при уменьшении концентрации солей в среде, под действием сульфаниламидных и других химических препаратов, звуковых колебаний, механического растирания, при экстракции различными растворителями, медленном автолизе и др.

По температурному оптимуму роста

Анатоксины

Билет № 26

1. Основные принципы культивирования бактерии.Питательные среды. Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах. 1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.2.Оптимальные температура, рН, rH 2 , концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации. По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.Краткая характеристика питательных сред. По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды. Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.По назначению среды разделяют на ряд групп:

Универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);- специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);- дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

Селективные (элективные)- для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Билет № 27

Анатоксины

Препараты, содержащие модифицированные химическим путем экзотоксины, лишенные токсических свойств, но сохранившие высокую антигенность и иммуногенность. Эти препараты обеспечивают выработку антитоксического иммунитета (антитоксических антител - антитоксинов). Наиболее широко используются дифтерийный и столбнячный анатоксины. АКДС - ассоциированная коклюшно- дифтерийно- столбнячная вакцина.

3 . Вирус кори - представитель рода Morbillivirus семейства парамиксовирусов. У него отсутствует нейраминидаза. Обладает гемагглютинирующей, гемолитической и симпластической активностью. Вирус имеет гемагглютинин, гемолизин (F), нуклеопротеид (NP) и матричный белок, отличающиеся антигенной специфичностью и иммуногенностью. Лабораторная диагностика .1.Метод экспресс - диагностики - обнаружение вирусных антигенов методом флюоресцирующих антител в пораженных клетках. 2. Вирусологическая диагностика - исследуют кровь до появления сыпи, слизь из носоглотки заражением культур клеток. Определяют цитопатический эффект, идентифицируют вирус в РТГА, РН и МФА.3. Серологические методы - РСК, РТГА, ИФА.Специфическая профилактика .Применяют живые аттенуированные вакцины. У контактных можно проводить серопрофилактику противокоревым иммуноглобулином или иммуноглобулином донорским нормальным.3.65 Полиовирусы. Полиомиелит.Полиовирусы вызывают полиомиелит - острую инфекцию с поражением нейронов. Важнейшее биологическое свойство полиовирусов - тропизм к двигательным клеткам серого вещества спинного мозга Капсид вириона образован четырьмя белками, образующими внешнюю (VP1, VP2, VP3) и внутреннюю (VP4) поверхности капсида. Белки оболочки имеют значение в распознавании и прикреплению к клеточным рецепторам, высвобождении вирионной РНК внутри клетки, развитии параличей.По антигенным свойствам полиовирусы подразделяют на три типа, наибольшей вирулентностью и эпидемической активностью обладают полиовирусы 1 типа.Лабораторная диагностика 1.Вирусологическая диагностика включает выделение вируса на различных культурах клеток или на новорожденных белых мышах, с последующей идентификацией по цитопатическому эффекту, в РН, РТГА, РСК с эталонными сыворотками.2. Серологическая диагностика осуществляется в различных реакциях (в настоящее время - ИФА), необходимо исследование в парных сыворотках, выявление специфических IgM - антител.Иммунитет и специфическая профилактика .Иммунитет к полиовирусам прочный, обусловленный вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти. Для специфической профилактики используют убитые и живые ослабленные вакцины.

Билет № 28

1. Основные методы культивирования вирусов .

1.В организме лабораторных животных.2.В куриных эмбрионах.3.В клеточных культурах - основной метод. Типы клеточных культур. 1.Первичные (трипсинизированные) культуры- фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т.д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.2.Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).3.Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе- например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.2. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) - клеточно- опосредованная гиперчувствительность или гиперчувствительность типа 4, связанная с наличием сенсибилизированных лимфоцитов. Эффекторными клетками являются Т- клетки ГЗТ , имеющие CD4 рецепторы Сенсибилизацию Т- клеток ГЗТ могут вызывать агенты контактной аллергии (гаптены), антигены бактерий, вирусов, грибов, простейших. Близкие механизмы в организме вызывают антигены опухолей в противоопухолевом иммунитете, генетически чужеродные антигены донора- при трансплантационном иммунитете.Т- клетки ГЗТ распознают чужеродные антигены и секретируют гамма- интерферон и различные лимфокины, стимулируя цитотоксичность макрофагов, усиливая Т- и В- иммунный ответ, вызывая возникновение воспалительного процесса.Исторически ГЗТ выявлялась в кожных аллергических пробах (с туберкулином- туберкулиновая проба), выявляемых через 24 - 48 часов после внутрикожного введения антигена. Развитием ГЗТ на вводимый антиген отвечают только организмы с предшествующей сенсибилизацией этим антигеном.Классический пример инфекционной ГЗТ - образование инфекционной гранулемы (при бруцеллезе, туберкулезе, брюшном тифе и др.). Гистологически ГЗТ характеризуется инфильтрацией очага вначале нейтрофилами, затем лимфоцитами и макрофагами. Сенсибилизированные Т- клетки ГЗТ распознают гомологичные эпитопы, представленные на мембране дендритных клеток, а также секретируют медиаторы, активирующие макрофаги и привлекающие в очаг другие клетки воспаления. Активированные макрофаги и другие участвующие в ГЗТ клетки выделяют ряд биологически активных веществ, вызывающих воспаление и уничтожающих бактерии, опухолевые и другие чужеродные клетки - цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, альфа- фактор некроза опухолей), активные метаболиты кислорода, протеазы, лизоцим и лактоферрин.3. Стафилококки. В состав рода входит более 20 видов, из которых наибольшее значение имеют S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus.Грамположительные кокки, для которых характерно взаиморасположение скоплениями в виде гроздей винограда. Имеют микрокапсулу, спор не образуют, жгутиков не имеют.Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Хорошо растут на простых питательных средах На плотных средах образуют непрозрачные круглые (2-4 мм в диаметре) ровные колонии, окрашенные в цвет липохромного пигмента (кремовый, желтый, оранжевый). Кроме S- форм колоний могут образовывать R- формы. На жидких средах дают равномерное помутнение, затем выпадает рыхлый осадок.Обладают высокой биохимической активностью, образуют различные ферменты Каталаза- положительны, оксидаза- отрицательны. Углеводы ферментируют до кислоты без газа, разжижают желатин с образованием воронки, образуют сероводород. По наличию коагулазы их делят на две группы - коагулаза- положительные и коагулаза- отрицательные. Среди патогенных видов коагулаза - положителен лишь S.aureus, остальные - отрицательны.Видоспецифическими антигенами являются тейхоевые кислоты, белок А золотистого стафилококка. Антигенными свойствами обладают токсины.Факторы патогенности микрокапсулу, компоненты клеточной стенки (тейхоевые кислоты, белок А), ферменты и токсины. Факторами адгезии являются высокие гидрофобные свойства поверхностных структур. Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций, основное значение в них имеют нейтрофилы. Разнообразные ферменты стафилококков играют роль факторов агрессии и защиты. Главным фактором является плазмокоагулаза, свертывающая сыворотку (плазму) крови и образующая тромбиноподобное вещество, обвалакивающее стафилококки и препятствующее действию защитных реакций организма. Экзотоксины:Мембраноповреждающие токсины могут повреждать эритроциты (гемолизины), лейкоциты, макрофаги, тромбоциты и др. Выделяют несколько типов, отличающихся по антигенной структуре, спектру лизируемых клеток, скорости действия.Эксфолиативные токсины оказывают дерматонекротическое действие (пузырчатка новорожденных).Экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока. Высокосорбционные тампоны вызывали тяжелый эндотоксический шок у женщин.Энтеротоксины, с которыми связаны пищевые интоксикации. Энтеротоксины - термостабильные белки со свойствами суперантигенов. Они вызывают избыточный синтез интерлейкина 2, который и обусловливает интоксикацию. Интоксикации чаще связаны с употреблением инфицированных стафилококками молочных продуктов.5. Ряд экзотоксинов и других структур стафилококков обладают аллергизирующим действием, обусловливая эффект развития ГЗТ. Наличие перекрестно - реагирующих антигенов способствует развитию аутоиммунных процессов.6. Факторы, угнетающие фагоцитоз - капсула, белок А, тейхоевые кислоты, пептидогликан, токсины.Особые свойства возбудителя. 1. Способность поражать практически любую ткань и орган.2. Очень высокая устойчивость среди неспорообразующих бактерий к факторам внешней среды.3. Постоянное пребывание на кожных покровах и сообщающихся с внешней средой слизистых оболочках.4. Суперантигенные свойства.5. Высокая изменчивость и антибиотикорезистентность, что имеет важное значение для эпидемического процесса.Постинфекционный иммунитет при стафилококковых инфекциях можно разделить на клеточный и гуморальный, антибактериальный и антитоксическийВ защите важную роль имеют антитоксины, антибактериальные антитела, антитела против ферментов патогенности, Т- лимфоциты, фагоциты (тканевые макрофаги при локализованных формах).Лабораторная диагностика. Применяют бактериологические, микроскопические и серологические методы. Основным является бактериологический метод.Материал для исследования - кровь, гной, слизь из носа и зева, отделяемое ран, мокрота (при пневмонии), испражнения (при колите), подозрительные продукты, рвотные массы и промывные воды желудка, испражнения - при пищевых интоксикациях.Проводят бактериоскопию, выявляя грамположительные кокки в виде гроздей винограда (стафилококки). Высевают материал на простые питательные среды. Подозрительные колонии отбируют и пересевают для изучения на дифференциальные среды - на кровяной агар (гемолиз), молочно - солевой и молочно - желточно - солевой агары (за счет NaCl угнетается рост посторонней микрофлоры, использование сред позволяет лучше выявить пигмент и лецитиназу). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют наличие золотистого пигмента, плазмокоагулазную активность, сбраживание маннита, гемолиз, чувствительность к антибиотикам, проводят фаготипирование.Из серологических тестов чаще применяют РПГА и ИФА для выявления антител к видоспецифическим антигенам (тейхоевым кислотам).Для определения энтеротоксигенности чаще применяют биологический метод, определение энтеротоксина в реакции преципитации в агаре, определение РНК- азы (коррелирует с выработкой энтеротоксина).Профилактика и лечение Для проведения адекватной антимикробной терапии необходимо определение чувствительности культур к антибиотикам (прежде всего - к бета- лактамовым), в тяжелых и затяжных случаях применяют донорский антистафилококковый иммуноглобулин. Для создания иммунитета применяют стафилококковый анатоксин, создающий антитоксический иммунитет.

Билет № 29

1. Антибиотики Одним из универсальных механизмов антогонизма микроорганизмов является синтез антибиотиков, которые тормозят рост и размножение микроорганизмов (бактериостатическое действие) или убивают их (бактерицидное действие). Антибиотики- вещества, которые могут быть получены из микроорганизмов, растений, животных тканей и синтетическим путем, обладающие выраженной биологической активностью в отношении микроорганизмов.Существует ряд требований к антибиотикам- эффективность в низких концентрациях;- стабильность в организме и в различных условиях хранения;- низкая токсичность или ее отсутствие;- выраженный бактериостатический и (или) бактерицидный эффект;- отсутствие выраженных побочных эффектов;- отсутствие иммунодепрессивного воздействия.Первыми открытыми антибиотиками были пенициллин (Флеминг) и стрептомицин (Ваксман).

Антибиотики могут быть разделены по происхождению, направленности и спектру действия, по механизму действия .По происхождению антибиотики могут быть:- бактериального (полимиксин, грамицидин);- актиномицетного (стрептомицин, левомицетин, эритромицин);- грибкового (пенициллин);- растительного (рафанин, фитонциды);- животного происхождения (интерфероны, лизоцим).По спектру действия антибиотики разделяют на:- действующие преимущественно на грамположительную микрофлору- пенициллин, эритромицин;- действующие преимущественно на грамотрицательную микрофлору- полимиксин;- широкого спектра действия (на грам-плюс и грам-минус флору)- стрептомицин, неомицин;- противогрибковые- нистатин, амфотеррицин, леварин, низорал;- противотуберкулезные- стрептомицин, канамицин;- противоопухолевые- рифампицин;- противовирусные- интерферон, зовиракс, ацикловир.Антибиотики разделяют по механизму действия:- ингибиторы синтеза пептикогликана клеточной стенки (пенициллин, цефалоспорин, ванкомицин, ристомицин). Действуют на имеющих клеточную стенку растущие бактерии, не действуют на L- формы, покоящиеся формы бактерий;- ингибиторы синтеза белка (стрептомицин, левомицетин, тетрациклин);- ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, пуринов и аминокислот (налидиксовая кислота, рифампицин);- ингибиторы синтеза мембраны и цитоплазматической мембраны грибов (нистатин, полимиксин).

3. Пневмококки. Особое положение в роде Streptococcus занимает вид S.pneumoniae (пневмококк) - этиологический агент крупозной пневмонии, острых и хронических воспалительных заболеваний легких. От остальных стрептококков отличается морфологией (чаще диплококки в форме пламени свечи, плоскими концами друг к другу, обладают выраженной капсулой), антигенной специфичностью (имеют 83 серовара по капсульному полисахаридному антигену), высокой чувствительностью к желчи и оптохину, вызывают альфа - гемолиз. Главный фактор патогенности - полисахаридная капсула.Лабораторная диагностика. Основной метод диагностики - бактериологический. Материал для исследования - кровь, гной, слизь из зева, налет с миндалин, отделяемое ран. Решающим при исследовании выделенных культур является определение серогруппы (вида). Группоспецифические антигены определяют в реакции преципитации, латекс - агглютинации, коагглютинации, ИФА и в МФА с моноклональными антителами (МКА). Серологические методы чаще используют для диагностики ревматизма и гломерулонефрита стрептококковой этиологии - определяют антитела к стрептолизину О и стрептодорназе.

Ку льтивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.).

При культивировании поверхностнымспособом микроорганизмы выращивают на поверхности плотной, сыпучей среды или в тонком слое жидкой среды, при этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. На сыпучих средах поверхностным методом получают ферментные препараты. Поверхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности

Все способы культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. При глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать (подводить кислород в глубь жидкой среды). Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью .

Наиболее широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или пробирок, обеспечивая большее соприкосновение среды с воздухом и насыщение ее кислородом. Аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием (барботированием ) через толщу среды стерильного воздуха. Этот способ используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, кислот.

Преимущества глубинного культивирования заключаются в том, что этот способ не требует больших площадей и громоздкого оборудования, объем ферментаторов можно увеличить за счет увеличения высоты, простота обслуживания, возможность автоматизации, удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости.

Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом методе культивирования весь объем питательной среды засевают чистой культурой, и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Поскольку культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях. Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток питания и отравление вредными продуктами обмена. В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства (рис. 3.1).

Первая стадия – лаг-фаза, или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду. В этой фазе микроорганизмы не размножаются, а приспосабливаются к среде, происходит повышение содержания нуклеиновых кислот, увеличение размера. Эта стадия является подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т.е. ее росту и размножению.

Вторая стадия – фаза логарифмического роста(экспоненциальная) характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена. Время, необходимое для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации. В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 20-30 мин, их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16 и т.д.).

Третья стадия – стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется, и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.

Четвертая стадия – фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания).

Периодическое культивирование осуществляется во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Недостатком периодического культивирования являются нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной жизнедеятельности – фаза логарифмического роста – занимает небольшую часть производственного цикла.

В течение последних тридцати лет все большее значение приобретает более прогрессивный метод непрерывного культивирования микроорганизмов, который состоит в том, что культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает свежая питательная среда и с такой же скоростью отводиться культуральная жидкость. Посевной материал выращивается до стадии логарифмического роста и вносится в питательную среду. Длительность периода логарифмического роста зависит от количества питательных веществ в среде, а также от количества вредных продуктов обмена, выделяемых клеткой.

При большой скорости притока среда быстро обновляется, питательные вещества не успевают накопиться и культура поддерживается сколь угодно долго в активном состоянии, не достигая стадии отмирания. Несмотря на значительное аппаратное усложнение технологического процесса, метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом.

В последние годы активно разрабатывается и применяется метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном) состоянии – на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность.

Непрерывное культивирование очень перспективно и широко используется в пищевой и микробиологической промышленности и создает возможность автоматического поддержания заданных оптимальных условий, благодаря чему обеспечивается стандартность готового продукта при наименьших затратах.

76. Чем интересен объемно-доливной метод культивирования.

Когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалент­ною объема среды. Это приводит к регулярному омолаживанию культуры и к за­держке ее перехода к фазе отмирания.

77. Чем интересен подпитки метод культивирования.

По­мимо внесения питательного субстрата в реактор до введения в него биообъекта, в процессе культивирования в аппарат добавляют питательные вещества через определенные промежутки времени порциями или непрерывно «по каплям». Иногда дополнительно вносят биообъект.

78. Чем интересен диализный метод культивирования.

Питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность.

79. Как функционирует ферментер полного вытеснения

Открытая система полного вытеснения отличается от системы идеального смешения тем, что культура в ней не перемешивается, а представляет собой поток жидкости через трубку. Наиболее распространенным аппаратом для культивирования в данном случае является трубчатый ферментер. Этот принцип может использоваться на стадии брожения при производстве пива.

80. как функционирует ферментер полного смещения.

К ним относятся турбостаты, рН-статы. Культура в ней перемешивается.

81. Чем регулируются хемостаты и турбидостаты.

Хемостат- поступление питательной среды регулируется плотностью клеток.онтролируется напрямую: задается скорость потока и к ней подстраивается концентрация биомассы.

Турбидостат – регулируется плотностью клеток.контролируется по принципу обратной связи: скорость потока зависит от требуемой концентрации биомассы клеток на выходе.

82. Кривая роста популяции при переодическом культивирование с указанием фаз роста.

а) лаг-фазу - сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объ­еме биореактора; б) экспоненциальную фазу - бурное деление клеток, сбалан­сированный рост культуры; в) фазу замедленного роста, связанного с исчерпа­нием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболиз­ма; г) стационарную фазу - прирост клеток равен их убыли; д) фазу отмирания - постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.

83. Как на производстве сокращают лаг-фазу.

Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки из экспоненциальной фазы роста перенести в свежую среду того же состава и той же температуры.

84. Чем отличается время генерации и время удвоения биомассы.

Время генерации – период удвоения клеток.

Время удвоения – период необходимая для удвоения биомассы.

Пример: для растений: время генерации-20-70 часов

Время удвоения – 1-2 недели

85. Формула абсолютной скорости роста.

Прирост числа клеток за определенный промежуток времени.

86. Удельная скорость роста (две формулы).

µ- удельная скорость роста(прирост клетки за час)

µ=V/x исход= dx/dt * 1/x

µ=2,3(lg X – lgXo)/t1-t2

87. Классификация непрерывных систем культивирования.

Открытые

А) гомогенно-непрерывные

-одноступенчетые

- многоступенчетые

а) простые

б) сложные

Б) гетерогенно – непрерывные

- трубчатые

- противоточные

2) замкнутые(механическое определение клеток)

А) 100% рецикуляция

Б) рост в интерфазе

88. В каких системах устанавливается равновесно подвижное состояние. (Точно в каких системах не нашла, только равенство)

µ= dx/dt*1/x или dx/dt = µ*b условие непрерывного культивирования мгновенный прирост биомассы компенсируется уносом биомассы со средой (Dх) т.е µx –Dx=0 или (µ-D)*x=0, откуда D=µ, это равенство основное условие поддержания равновесия.

89.Как функционирую трубчатые ферментеры.

Трубчатый ферментер (газлифтный) состоит из реактора кожухотрубчатого типа, через который жидкость потоком воздуха перемещается в верхнюю часть аппарата и, попадая в сепаратор, возвращается в реактор, где снова увлекается воздухом, подвергаясь таким образом циркуляции.

90. Как функционирует противоточные ферментеры.

Барботажные ферментеры. Подача воздуха в них осуществляется через борбатажные устройства, которые расположены в нижней части а

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для их жизнедеятельности.

ПРИНЦИПЫ СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах, поэтому питательная среда должна содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред.

По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы.

Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту - соединение, содержащее углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация углекислоты в воздухе не превышает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффузии недостаточно для интенсивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (NаНС) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (СаС). В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный 1-5% углекислоты.

Потребности гетеротрофных микроорганизмов не могут быть удовлетворены только углекислотой. Для их развития среда должна содержать органические соединения. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения yглepoдa - кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. При этом потребности некоторых микроорганизмов, например ряда бактерий из семейства Pseudoтonadaceae, могут быть удовлетворены широким набором различных органических веществ, тогда как другие микроорганизмы характеризуются высокой специализацией и способностью использовать лишь немногие соединения углерода, Так, некоторые метанокисляющие бактерии используют только метан и метанол.

Вторым основным компонентом питательной среды является источник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме - в виде амино(-N) или имино(-NН)-групп. Тем не менее потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды вносят NCl или (N)S. Следует, однако, помнить, что аммонийные соли - физиологически кислые соли, так как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион соответствующей кислоты. Что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие микроорганизмов. Гидроксид аммония (NНОH) в качестве источника азота используют редко, пocкoльку он вызывает сильное подщелачивание питательных сред.

Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирования таких микроорганизмов содержат КNО или NaNО. В отличие от солей аммония нитраты - физиологически щелочные соли, так как при использовании аниона NО- в среде накапливаются катионы К+ или Na+. Нитриты в кислых условиях для многих микроорганизмов токсичны, поэтому в качестве источника азота почти не используются.

Питательные среды для культивирования микроорганизмов, более требовательных к азоту и соответственно обладающих меньшими биосинтетическими способностями, должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- или DL- форме добавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г на 100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, пролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллированной воде, фенилаланин и триптофан - в дистиллированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокислоты - в дистиллированной воде, подкисленной HCl. Аминокислоты - цистин и цистеин, а также амиды - глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин.

Потребности микроорганизмов в нескольких аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, казеин) или растительного (семена сои, подсолнечника) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолитических ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с терпкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще других используют гидролизат казеина, который готовят в лабаратории, как правило, кислотным гидролизом. Для этого 20 г казеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентрированной HSO и выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 атм. Однако при этом подвергается коррозии оборудование автоклава, поэтому чаще гидролизат казеина получают иначе. К 200 г казеина добавляют 280 мл 6н раствора НСl, и смесь кипятят с обратным холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют 50%-ным раствором NaOH до рН 7, фильтруют; через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Содержание аминного азота в гидролизате, полученном таким способом, составляет 700 - 1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в таком количестве, чтобы концентрация по аминному азоту составляла 10-30 мг на 100 мл. Следует иметь в виду, что при кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, в достаточно большой степени цистеин и незначительно серин и треонин. Имеется готовый препарат гидролизата казеина. Его вносят в среды от 0,1 до 1,0 г на 100 мл в зависимости от потребностей микроорганизмов.

Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления- пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солей и микроэлементов. Их получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного (соевая мука) происхождения. В отечественных лабораториях чаще всего используют ферментативный пептон, выпускаемый Семипалатинским заводом. Это гигроскопический порошок светло-желтого цвета, полностью растворимый в воде; 1 %-ный раствор пептона имеет нейтральную или слабокислую реакцию. В питательные среды пептон добавляют от 1-2 до 20 г на 1 л.

Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорганизмы могут использовать не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии.

Некоторые бактерии способны использовать в качестве единственного источника азота молекулярный азот - N. Это азотфиксаторы. В среды для культивирования таких микроорганизмов соединений азота можно не вносить. Снабжение азотфиксаторов газообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота.

Помимо источников углерода и азота многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокнслоты. Для того чтобы подчеркнуть потребность, микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термины «прототрофы» и «ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Этими терминами особенно широко пользуются в литературе по генетике. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин (витамин В), пантотенат Са, рибофлавин (витамин B), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, кобаламин (витамин B) - по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кислота и n-аминобензойная кислота - по 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин - 0,005 мкг на 1 мл среды.

Витамины добавляют к стерильной среде непосредственно перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать растворы, в которых концентрация витамина превышает его содержание в питательной среде в 100 раз. Paстворы готовят в стерильной посуде и используют стерильную дистилированную воду. Исключение составляют рибофлавин и фолиевая кислота. Рибофлавин растворяют в 0,02 н уксусной кислоте, а фолиевую кислоту - в 0,01 н NaOH, доводя затем концентрацию NaOH в растворе до 0,001 н. Полученные растворы стерилизуют прогреванием в кипящей водяной бане 3 мин. Раствор тиамина рекомендуется стерилизовать фильтрованием, так как при нагревании тиамин разрушается. При температуре +4 растворы витаминов сохраняются не менее месяца. Растворы фолиевой кислоты. пиридоксина и рибофлавина сохраняют в темноте, так как они светочувствительны.

Примерами смесей, содержащих факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный экстракт. Дрожжевой экстракт вносят в среду для культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автолизат - в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота составляла 5-30 мг на 100 мл среды. Дрожжевой экстракт

имеется в продаже. Дрожжевой автолизат готовят следующим образом: 40 г свежих прессованных или 10 г сухих дрожжей заливают водой и перемешивают до получения гомогенной массы, затем добавляют несколько кристаллов тимола или 1-2 мл хлороформа и выдерживают в термостате при 50-55 3 суток. За это время клетки дрожжей отмирают, а ферменты остаются активными и гидролизуют белки, а также другие биополимеры. Через 3 суток полученный автолизат после тщательного перемешивания кипятят на слабом огне 20 мин и фильтруют через бумажную пульпу, используя воронку Бюхнера. Содержание аминного азота определяют формальным титрованием. Дрожжевой автолизат стерилизуют при 0,5 атм 15 мин и сохраняют в холодильнике.

Кукурузный экстракт - готовый продукт заводов крахмало-паточной промышленности. Он содержит аминокислоты, витамины, достаточно большое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт вносят в среды от 0,5 до 5 г на 10 мл; стерилизуют при 0,5 атм.

Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроорганизмам для построения веществ клетки необходимы сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других зольных элементах удовлетворяются обычно за счет минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для культивирования многих микроорганизмов может быть близким по составу. Так, потребности подавляющего большинства микроорганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп. Значительно реже встречаются микроорганизмы, требующие наличия в среде восстановленной серы. В этом случае в среду вносят сульфиды, чаще всего NaS, или органические соединения, содержащие сульфгидрильные группы, например цистеин.

Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганизмов в фосфоре. Все необходимые металлы - К, Na, Са, Mg, Fe, Мn, Co, Сu - и другие элементы микроорганизмы получают в форме катионов или анионов неорганических солей. Например, источником магния служит MgSO источником натрия и хлора - NaCl, кальция - СаСОили CaCl. Железо добавляют к средам в виде хлорида, сульфата или цитрата.

Для того чтобы избежать выпадения осадка в результате образования нерастворимых комплексов фосфатов с некоторыми катионами, особенно с железом и кальцием, к средам рекомендуется добавлять от 0,001 до 1 г/л этилендиаминтeтраацетат (ЭДТА) или гексаметафосфат натрия в концентрации 4 г/л. Комплексы, образуемые этими соединениями с катионами, служат резервом, из которого в результате диссоциации в раствор поступают свободные катионы.

Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно больших количествах, поэтому их соли, как правило, включают в состав питательных сред. Потребности микроорганизмов в марганце, молибдене, цинке, меди, кобальте очень малы. Эти элементы, часто называемые микроэлементами, вносят в среды от 1 мг дo l мкг на 1 л; более высокие концентрации могут быть токсичны. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред, которые готовятся на дистиллированной воде, их следует вносить. Об оптимальных концентрациях микроэлементов для разных микроорганизмов известно мало, поэтому предложены различные по составу смеси микроэлементов.

Смесь микроэлементов по Дрюсу (Drews, 1976), мг: ЭДТА Na-800; MnCl*4HO-10; CoCl*6HO-4; CuSO-1; NaMoO*2НО - 3;ZnCl-2; LiCl - 0,5; SnCl*2H0;- 0,5; НВО - 1, КВг-2; KJ -2; BaCl-0,5; вода дистиллированная-1000 мл; рН 6,0. На 1 л среды добавляют от 5 до 10 мл этого раствора.

Cмесь микроэлементов по Пфеннигу (Pfennig, 1965), мг: ЭДТА-500; FeSO*7 HO-200; ZnSO*7 HО-10; МnСl.4 HО-3; НВО-30; CoCl*2 HO - 20; CuCl*2 HO - 1; NiCl*6 HO - 2; NaMoO*2 HО - 3; вода дистилированная - 1000 мл. На 1 л среды добавляют от 1 до 10 мл этого раствора. Растворы микроэлементов рекомендуется стерилизовать отдельно и вносить в среду непосредственно перед ее засевом.

Питательные среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетический материал. По способу получения энергии все микроорганизмы принято делить на две основные группы: хемотрофы и фототрофы.

Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата (донора водорода) среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Первые окисляют неорганические соединения, такие как HS, S или другие не вполне окисленные соединения серы, H, NH+, NO- или Fe. Эти соединения в средах для культивирования хемолитотрофных бактерий выполняют прежде всего функцию энергетического материала. Для хемоорганотрофов энергетическим субстратом служат органические вещества, которые обычно играют двоякую роль, являясь одновременно и источником углерода и источником энергии. Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и энергетических процессов нуждаются в разных соединениях. Например, гомоферментативные молочнокислые бактерии получают энергию при сбраживании сахаров, но почти не используют их в процессах биосинтеза. Для конструктивных целей им необходимы готовые аминокислоты, пуриновые или пиримидиновые основания, витамины.

Фототрофы используют энергию света. Чтобы удовлетворить потребности этих бактерий в энергии, их культивируют при дневном или искусственном освещении.

По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.

Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, разведенная кровь, молоко, воды морей, озер и минеральных источников, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, таких как мясо, почва, навоз, различные части растений, клетки микроорганизмов.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и малопригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей. К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной практике, относятся мясо-пептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенный экстракт.

Мясо - пептонный бульон (МПБ). Основой для его приготовления служит мясная вода, которую обычно готовят следующим образом: 500 г мяса, освобожденного oт костей, жира и сухожилий, мелко нарезают или пропускают через мясорубку, заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 ч или в термостате при 30 на 6 ч, а при 37 - на 2 ч. За это время из мяса экстрагируются различные вещества, в том числе водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объёма. К мясной воде добавляют 1 % пептона и 0,5% NaCl.

МПБ - богатая питательная среда, но она почти не содержит углеводов. В случае необходимости их добавляют к МПБ чаще всего в количестве 1-2 г на 100 мл. МПБ стерилизуют при 1 атм.

Солодовое (неохмеленное пивное) сусло - хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, микроскопических грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов. Основные компоненты сусла - углеводы (до 90% от общей массы сухого остатка) и азотсодержащие соединения (до 6-7% от общей массы сухого остатка). Из углеводов в наибольшем количестве содержатся мальтоза и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимущественно группы В, органические кислоты и минеральные соли.

Сусло готовят следующим образом. 250 г размолотого солода заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48 - 50 и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие Полчаса температуру поднимают до 55-58 и поддерживают на этом ypовне до полного осахаривания крахмала, т. е до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через бумажную пульпу или вату. В фильтрате определяют концентрацию caхapa, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (Б) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в сусле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаще всего используют 3 - 4Б сусло, для дрожжей - 6-8Б, а для наиболее требовательных молочнокислых бактерий - 8-12Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Дрожжевая среда используется в основном для культивирования ряда гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды - дрожжевая вода. Для её приготовления 70 - 100 г свежих прессованных или 7 - 10 г сухих дрожжей 30 мин кипятят в 1 л воды и после осаждения клеток дрожжей жидкость декантируют или фильтруют через вату. К фильтрату добавляют 1 л воды, ещё раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожжевой воды добавляют 1-2 г углеводов и минеральные соли, чаще всего KHPO (0,1г) и NaCl (0,5 г). Доводят pH среды до 6,8-7,2. Среду стерилизуют при 0,5 атм 20 - 30 мин.

Картофельная среда используется в основном для культивирования спорообразующих бактерий, представителей рода Caulobacter и некоторых других хемоорганотрофных бактерий. Для приготовления этой среды 200 г тщательно вымытого и очищенного от кожуры и глазков картофеля нарезают мелкими ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 20 - 30 мин. Отвар фильтруют через вату, доводят объем фильтрата до 1 л и разливают в сосуды для культивирования. Среду стерилизуют 1 ч при 1 атм или 30 мин при 1,5 атм.

Почвенный экстракт используют главным образом для культивирования разнообразных представителей почвенной микрофлоры. Для его приготовления 500 г плодородной почвы заливают 1,5 л водопроводной воды и автоклавируют при 1 атм 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр, добавляют к горячему фильтрату 0,5 г СаСО, тщательно перемешивают и через 5-7 мин фильтруют вновь. К экстракту, как правило, добавляют 0,2 г КHPO на каждые 1000 мл. Стерилизуют при 1 атм.

Синтетические среды - это среды, в которые входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Синтетические среды широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Для разработки состава синтетических сред, обеспечивающих рост микроорганизмов или усиленный биосинтез какого-либо продукта жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и потребности его в источниках питания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным средам неопределенного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть, и довольно простыми по составу. Рецепты некоторых синтетических сред приведены в приложении.

Наряду с натуральными и синтетическими средами выделяют так называемые полусинтетические среды . Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического состава - углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и т. д. Однако в их состав всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных, продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Следует иметь в виду, что среды, обеспечивающие хорошее развитие микроорганизмов вceгдa подходят для решения других исследовательских и практических задач, так как далеко не во всех случаях накопление какого либо продукта жизнедеятельности - фермента, витамина, антибиотика и т. д. идет параллельно накоплению биомассы.

Нередко при обильном росте микроорганизмов, желаемый продукт метаболизма почти не образуется или образуется в недостаточном количестве. Чтобы обеспечить необходимого соединения в максимально возможных количествах, применяются специальные среды. Подбор концентрации и соотношения компонентов среды осуществляют, используя методы математического планирования эксперимента, которые достаточно подробно изложены в книге В. Н. Максимова (1980).

Элективные среды предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Они обеспечивают преимущественно е развитие определённой группы микроорганизмов, для которой характерна общность физиологических свойств. Подробнее об этих средах см. с. 108 - 109.

Дифференциально - диагностические (индикаторные) среды дают

Возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления бактерий из группы кишечной палочки в естественных субстратах служит агаризованная среда Эндо следующего состава, г: пептон- 10; лактоза-10; КHPO -3,5; NaHsO-2,5; агар - 150; вода дистиллированная - 1000 мл; pH 7,4. К среде добавляется 4 мл 10%-ного спиртового раствора основного фуксина. Среду стерилизуют при 1 атм 15 мин и сохраняют в темноте. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском.

При определении видовой принадлежности бактерий используют pH-индикаторные среды, в состав которых входит один из индикаторов - нейтральный красный (0,0005%), феноловый красный (0,005%) или бромтимоловый синий (0,0005%). Если развитие микроорганизмов сопровождается образованием кислоты или щелочи, цвет индикатора изменяется, Дифференциально-диагностические среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и плотные среды.

Жидкие среды широко применяют для накопления биомассы или пpoдуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии микроорганизмов, а также для поддержания и сохранения в коллекции культур микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.

Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.

Плотные среды используют для выделения чистых культур, в диагностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекциях и в ряде других случаев. С целью уплотнения сред применяют агар или жeлатин. Плотной основой могут служить пластинки силиката, которые пропитывают питательной средой.

Рисунок 41. Приготовление скошенной агаризованной среды в пробирках

Агар используют для уплотнения сред особенно часто. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входит сахароза и агаропектин. Кроме того. Агар включает небольшое количество легко ассимилируемых веществ и различные соли. Агар получают из некоторых морских водорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 100 °C и затвердевает при температуре 40°C.

Поэтому на агаризованных средах можно культивировать значительную часть известных в настоящее время микроорганизмов.

Чаще всего агар добавляют к средам в количестве 1,5%. Если необходимо получить более влажную среду, вносят 1,0%, а более плотную и сухую -2-3% агара. Среду с агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного его расплавления. Если предполагают выращивать микроорганизмы на скошенной агаризованной среде в пробирках, то каждую пробирку заполняют средой не более чем на 1/3. Чтобы среда не подсыхала, ее скашивают после стерилизации, перед посевом. Для этого пробирки с расплавленной на кипящей водяной бане средой устанавливают в наклонном положении (рис. 41) и дают среде застыть. Скошенная агаризованная среда не должна доходить до ватной пробки на 4-6 см. Среду, предназначенную для культивирования бактерий в чашках Петри, разливают по 20-25 мл в пробирки большего объема, чем для скошенной агаризованной среды, или стерилизуют в колбах. В последнем случае до стерилизации агар не расплавляют.

При остывании агаризованных сред образуется конденсационная вода. Чем меньше концентрация агара, тем больше выделяется воды. Поэтому при выращивании микроорганизмов на поверхности агаризованных сред в чашках Петри с целью получения изолированных колоний чашки помещают в термостат крышками вниз. В противном случае на внутренней стороне крышки скапливается конденсат, который, стекая на поверхность среды, мешает получению изолированных колоний.

Агар имеет слабощелочную реакцию, поэтому его добавление может привести к незначительному повышению рН среды. В слабокислых, нейтральных или слабощелочных средах агар сохраняет способность образовывать гель после нескольких циклов плавления и затвердевания и даже после повторной стерилизации. Однако необходимо помнить, что при рН среды ниже 5,5 агар при стерилизации частично гидролизуется и поэтому теряет способность образовывать гель, т. е. не застывает. В этом случае его стерилизуют отдельно от среды в определенном объеме воды, расплавляют на водяной бане и приливают при постоянном перемешивании к стерильной, предварительно подогретой среде.

Агар, как указывалось выше, содержит примеси органических и минеральных веществ, которые иногда нежелательны. Чтобы избавиться от большинства из них, поступают следующим образом. Агар заливают водопроводной водой и ставят в термостат на 30-37. Примеси вымываются в воду и разлагаются под действием развивающихся в ней микроорганизмов. Через день-два жидкость сливают, агар промывают несколько раз свежей водой, снова заливают водой и вновь ставят в термостат. Когда и эта вода помутнеет, то ее опять заменяют новой, и так делают до тех пор, пока не исчезнет запах, а вода не перестанет мутнеть. Обычно через 2-3 недели получают агар, почти лишенный растворимых органических и минеральных веществ. Воду сливают, агар помещают в двойной марлевый мешок и 2-3 суток промывают проточной водопроводной водой, затем раскладывают его тонким слоем и просушивают на воздухе или в сушильном шкафу при 40-50.

Желатин - это экстракт, получаемый" из субстратов, богатых коллагеном - белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи. Образуемый желатином гель плавится при температуре 25°С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30 - 37°С). Кроме того, желатин разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатина ограничивают его применение в качестве уплотняющего средства. Желатин используют главным образом в диагностических целях - для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также для получения гигантских и глубинных колоний дрожжей. В первом случае употребляют мясо - пептонный, во втором - сусловый желатин.

К жидким средам добавляют 10 - 20% желатин, оставляют набухать 5-10 мин и нагревают на водяной бане до растворения. Доводят рН среды до 6,8-7,0.Желатин имеет кислую реакцию и обладает большой буферностью, поэтому на нейтрализацию идет больше щелочи, чем, например, на нейтрализацию МПА. Желатиновые среды стерилизуют при 0,5 атм 15 мин или дробно - 3 раза по 20 мин в кипятильнике Коха. Повторная стерилизация желатиновых сред, особенно при рН сред ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, поскольку желатин частично гидролизуется и теряет гелеобразующие свойства.

Кремнекислый гель (силикагель) используют как твердую основу для синтетических сред строго определенного состава.

Гель готовят следующим образом. К соляной кислоте плотностью

1,1 добавляют при перемешивании равный объем раствора жидкого стекла (NаSiO или КSiO) той же плотности., Смесь разливают в чашки Петри по 20-30 мл в каждую и оставляют чашки на горизонтальной поверхности на несколько часов до образования кремнекислого геля. Когда гель станет плотным, открытые чашки помещают в стеклянный или эмалированный сосуд, промывают 2-3 суток проточной водой для удаления хлоридов, а затем несколько раз горячей дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качественной пробе промывных вод с 1 - 5%-ным раствором азотнокислого серебра: при наличии хлоридов образуется белый осадок. Отмытые от хлора пластинки пропитывают 2-3 мл концентрированной среды, содержание компонентов в которой в 5-10 раз выше, чем в соответствующей жидкой среде. Затем чашки с гелевыми пластинками помешают открытыми в сушильный шкаф и подсушивают при 50-60, следя за тем, чтобы гель не растрескался и его поверхность осталась влажной. Если необходимо, чашки завертывают в бумагу и, не переворачивая, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 15 мин. Пластинки, предназначенные для выделения и культивирования автотрофных бактерий, можно не стерилизовать. Стерилизуют только среду, которой пропитывают гель. Чашки с силикагелевыми пластинками сохраняют до употребления под водой.

Некоторые специфические особенности агара, желатин и кремнекислого геля суммированы в таблице 3.

Таблица 3.-Основные особенности веществ, употребляемых для уплотнения питательных сред

Следует помнить, что все среды с агаром или желатином следует относить к натуральным средам неопределенного состава.

Осветление сред . Осветленные агаризованные или желатиновые среды необходимы для некоторых специальных исследований, например для получения хорошо видимых изолированных колоний анаэробных микроорганизмов.

В ряде случаев прозрачную среду можно получить, отфильтровав ее от осадка через гигроскопическую вату. Когда этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков куриного яйца. Для осветления 500 мл среды достаточно белка одного яйца. Бeлок отделяют от желтка и встряхивают с равным объемом воды до образования сплошной пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплавленную и остуженную до 45-50 среду. Перед внесением белка проверяют рН и, если необходимо, подщелачивают среду до рН 7,0-7,3. Среду с белком тщательно перемешивают и прогревают при 100 в автоклаве или в кипятильнике Коха в течение часа. Белок свертывается и адсорбирует все взвешенные в среде частицы. Когда свернувшийся белок поднимется на поверхность или опустится вниз, среду быстро отфильтровывают в горячем виде через вату. При этом удобно пользоваться специально подогреваемыми подставками для воронок, благодаря которым предотвращается застывание среды во время фильтрования.

Синтетические агаризованные среды, в которые вносить белок нежелательно, осветляют следующим образом. Среду наливают в химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 10-12 ч, обычно на ночь. При таком медленном остывании все взвешенные частицы оседают на дно. Застывшую агаризованную среду извлекают из стакана, верхнюю, прозрачную часть срезают, помещают в колбу и вновь стерилизуют.

Посуда, предназначенная для приготовления сред и культивирования микроорганизмов, не должна содержать посторонних веществ. Лучше всего пользоваться стеклянной посудой. Новую стеклянную посуду моют и погружают на ночь в 1-2%-ный раствор соляной или серной кислот, затем многократно промывают водой и высушивают. Иногда для работы с микроэлементами, витаминами, синтетическими и другими средами требуется особо тщательная очистка посуды. Натуральные среды неопределённого состава можно готовить в эмалированной посуде.

Не следует готовить впрок больших запасов сред, так как они высыхают, концентрируются и становятся непригодными. Сохраняют среды в прохладном, защищенном от света и не слишком влажном помещении. В сырости ватные пробки пропитываются влагой и через них может прорасти мицелий микроскопических грибов. Каждый сосуд со средой должен иметь этикетку с обозначением состава (названия) среды и времени ее приготовления.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу , а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки. Первые предварительно из­готовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец ка­пилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец за­крывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами над г писывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Для того чтобы культура микроорганизмов могла нормально расти, размножаться и осуществлять биосинтез какого-либо вещества, необходимы благоприятные условия окружающей среды. При неблагоприятных условиях изменяются свойства микроорганизмов, подавляется их жизнедеятельность или происходит гибель. При неблагоприятных условиях изменяются свойства микроорганизмов, подавляется их жизнедеятельность или происходит гибель.

Физические – температура, влажность среды, концентрация питательных веществ.

К химическим факторам , которые влияют на жизнедеятельность микроорганизмов, относятся: рН среды, окислительно-восстановительный потенциал (гН2) и присутствие в среде токсичных веществ.

Биологические факторы – сводятся к взаимоотношению между микроорганизмами, соприкасающимися в процессе своей жизнедеятельности.

Культуральные свойства бактерий – питательные потребности, условия роста и характер роста бактерий на бактериол. средах. В питательные , азота и ростовых факторов, способность бактерий расти на определенных питательных средах, в условия роста - рН, Eh, концентрацию О2 плотность, осмотическое давление среды, температуру роста; в характер роста - скорость роста (быстрый, медленный), внешний вид к-ры на жидких, плотных и полужидких средах, изменения, к-рые наступают в среде или отдельных ее компонентах в процессе роста микробов. Сведения о К.с. используют при выборе способов культивирования и при идентификации выделенной к-ры

30. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты -биовары (син: биотипы). Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам - сероварами, по чувствительности к фагу-фаговарами. Культуры микробов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирку с твердой или, реже, жидкой питательной средой.

Колония представляет собой изолированное скопление бактерий одного вида, или биовара, выросших на плотной питательной среде в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру -бактерий получают для проведения диагностических исследований , которые заключаются в идентификации, т. е. определении родовой и видовой принадлежности выделенных бактерий. Это достигается путем изучения их морфологических, культуральных, биохимических и других признаков (см. схему 1).

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические признаки бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.

Для идентификации бактерий до рода и вида имеют значение пигменты, окрашивающие колонии и культуры в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens (палочка чудесной крови), золотистый пигмент-Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент-Pseudomonas aeruginosa (палочка синезе-леного гноя).

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выполнению соответствующего маркера - определению фермента, антигена, чувствительности к фагам.

31. Микрофлора почвы, воды, воздуха. Патогенные виды, сохраняющиеся во внешней среде и передающиеся через почву, воду, пищевые продукты, воздух.

Почва. В зависимости от глубины залегания слоя почвы меняется и состав ее микрофлоры. В верхних слоях, богатых растительными и животными остатками, а также хорошо снабженных воздухом, преобладают аэробные микроорганизмы, способные разлагать сложные органические соединения. В более глубоких почвенных слоях содержится меньше органических соединений и воздуха, вследствие чего там преобладают анаэробные бактерии.

Почва служит местом обитания спорообразующих палочек родов Bacillus и Clostridium. Непатогенные бациллы (Вас. megatherium, Вас. subtilis и др.) наряду с псевдомонадами , протеем и некоторыми другими бактериями являются аммонифицирующими, составляя группу гнилостных бактерий, осуществляющих минерализацию белков. Патогенные палочки (возбудитель сибирской язвы, ботулизма, столбняка, газовой гангрены) способны длительно сохраняться в почве.

В почве находятся также многочисленные представители грибов. Грибы участвуют в почвообразовательных процессах, превращениях соединений азота, выделяют биологически активные вещества, в том числе антибиотики и токсины. Токсинообразующие грибы, попадая в продукты питания человека, вызывают интоксикации - микотоксикозы и афлатоксикозы.

Микрофлора воды отражает микробный состав почвы, так как микроорганизмы, в основном, попадают в воду с ее частичками. В воде формируются определенные биоценозы с преобладанием микроорганизмов, адаптировавшихся к условиям местонахождения, освещенности, степени растворимости кислорода и диоксида углерода, содержания органических и минеральных веществ.

В водах пресных водоемов обнаруживаются различные бактерии: палочковидные (псевдомонады, аэромонады), кокковидные (микрококки) и извитые. Загрязнение воды органическими веществами сопровождается увеличением анаэробных и аэробных бактерий, а также грибов. Микрофлора воды выполняет роль активного фактора в процессе самоочищения ее от органических отходов, которые утилизируются микроорганизмами. Вместе с сточными водами попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка, цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза, энтеровирусных инфекций). Таким образом, вода является фактором передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний. Некоторые возбудители могут даже размножаться в воде (холерный вибрион, легионеллы).

Микрофлора воздуха взаимосвязана с микрофлорой почвы и воды. В воздух также попадают микроорганизмы из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Солнечные лучи и другие факторы способствуют гибели микрофлоры воздуха. В воздухе обнаруживаются кокковидные и палочковидные бактерий, бациллы и клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы. Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений , микробная обсемененность которых зависит от степени уборки помещения, уровня освещенности, количества людей в помещении, частоты проветривания и др. Количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха (так называемое микробное число, или обсемененность воздуха) отражает санитарно-гигиеническое состояние воздуха, особенно в больничных и детских учреждениях. Косвенно о выделении патогенных микроорганизмов (возбудителей туберкулеза, дифтерии, коклюша, скарлатины, кори, гриппа и др.) при разговоре, кашле, чиханье больных и носителей можно судить по наличию санитарно-показательных бактерий (золотистого стафилококка и стрептококков), так как последние являются представителями микрофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроорганизмами, передающимися воздушно-капельным путем.

32. Санитарно – показательные микроорганизмы. Коли – титр, коли – индекс, методы определения.

Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно и с еще большей степенью вероятности судить о возможном присутствии патогенов во внешней среде.

Их наличие свидетельствует о загрязнении объекта выделениями человека и животных, так как они постоянно обитают в тех же органах, что и возбудители заболеваний, и имеют общий путь выделения в окружающую среду. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показательными бактериями, как бактерии группы кишечной палочки -(в группу входят сходные по свойствам бактерии родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella), энтерококки, клостридии перфрингенс. Возбудители воздушно-капельных инфекций имеют общий путь выделения с бактериями (кокками), постоянно обитающими на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, выделяющимися в окружающую среду (при кашле, чиханье, разговоре), поэтому в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки. Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим основным требованиям:

1. должны обитать только в организме людей или животных и постоянно обнаруживаться в их выделениях;

2. не должны размножаться или обитать в почве и воде;

3. сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из организма в окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патогенных микробов;

5. методы их обнаружения и идентификации должны быть простыми, методически и экономически доступными;

6. должны встречаться в окружающей среде в значительно больших количествах, чем патогенные микроорганизмы;

7. в окружающей среде не должно быть близко сходных обитателей - микроорганизмов.

Коли-индекс - количество особей кишечной палочки, обнаруживаемое в 1 л (для твердых тел в 1 кг) исследуемого объекта; определяется путем подсчета колоний кишечной палочки, выросших на плотной питательной среде при посеве определенного количества исследуемого материала, с последующим пересчетом на 1 л (кг). Коли-индекс - величина, пропорциональная фактическому содержанию кишечной палочки в исследуемом субстрате.

Коли-титр - это наименьшее количество исследуемого материала в миллилитрах (для твердых тел - в граммах), в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для определения коли-титра раздельно засевают на жидкие среды десятикратно уменьшающиеся объемы исследуемого материала (например, 100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл).

Для перевода коли-титра в коли-индекс следует 1000 разделить на число, выражающее коли-титр; для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 разделить на число, выражающее коли-индекс.

33. Микрофлора тела человека в различные возрастные периоды. Роль микробов – постоянных обитателей тела человека в физиологических процессах. Понятие о дисбактериозе, его классификация, проявления и методы лечения.

Микрофлора располагается только на коже и на слизистых оболочках полостей, сообщающихся с внешней средой (кроме матки и мочевого пузыря). Все ткани организма в норме совершенно свободны от микробов.

Естественная аутомикрофлора тела- единый природный комплекс, состоящий из совокупности гетерогенных микробоценозов в различных участках человеческого организма.

До рождения организм человека стерилен,- в утробе матери эмбрион защищен от вторжения микробов плацентарным и другими барьерами.

Микрофлора пищеварительного тракта - самая многочисленная и самая значимая для поддержания здоровья человека. Особенно велика ее роль в развивающемся детском организме.

Существует два критических момента в процессе формирования кишечного микробиоценоза. Первый - при рождении ребенка, когда в течение первых суток начинается колонизация стерильного кишечника, второй - когда ребенка отлучают от грудного вскармливания.

В ходе родов кожа и слизистые ребенка впервые соприкасаются с микрофлорой родовых путей матери, воздуха, рук медицинского персонала. Вследствие этого кишечная микрофлора первых дней жизни ребенка представлена ассоциацией аэробов (в основном факультативными анаэробами) - микрококками, энтерококками, клостридиями, стафилококками. К 4-5-му дню жизни видовой состав фекальной микрофлоры становится более разнообразным , появляются ассоциации неспорообразующих анаэробов (бифидобактерии, пропионибактерии, пептококки, пептострептококки, бактероиды и фузобактерии). Однако пока еще доминируют аэробные бактерии - лактобациллы, кокки, дрожжевые грибки.

Дальнейшее формирование аутомикрофлоры желудочно-кишечного тракта в основном зависит от типа вскармливания. При грудном вскармливанииу здоровых доношенных детей уже в конце первой - начале второй недели жизни в микробоценозе толстого кишечника за счет опережающих темпов роста отчетливо преобладает анаэробная составляющая (более 95%). Оставшаяся часть (около 4-5%) представлена разнообразными факультативными аэробами: лактобациллами, эшерихиями, энтерококками, эпидермальным стафилококком, дрожжевыми грибками.

Роль микробов – постоянных обитателей тела человека в физиологических процессах

Микробные биоценозы поддерживают нормальные физиологические функции и играют определённую роль в иммунитете. Нарушения в микробных биоценозах во многих случаях могут привести к возникновению патологических процессов в соответствующих органах.

Важную роль играет микрофлора толстой кишки. Она обладает выраженными антагонистическими свойствами (особенно анаэробные микробы) и препятствует развитию патогенных бактерий, которые могут попасть с пищей и водой в кишечник, а также гнилостных бактерий. Микробы – постоянные обитатели кишечника образуют бактериоцины, антибиотики, молочную кислоту, спирты, перекись водорода, жирные кислоты, которые подавляют размножение патогенных видов. Таким образом, анаэробы кишечника участвуют в обеспечении колонизационной резистентности, так как предотвращают колонизацию (заселение) слизистых оболочек посторонними микроорганизмами.

Микробы кишечника также участвуют в процессах пищеварения, водно-солевом, белковом, углеводном, липидном обменах, образуют на слизистой оболочке кишечника защитную плёнку, способствуют формированию и развитию иммунной системы, участвуют в обезвреживании токсических соединений, синтезируют биологически активные вещества (витамины, антибиотики, бактериоцины).

Большое значение имеет E. сoli, которая обладает высокой ферментативной активностью, синтезирует витамины B1, B2, B12, B5, K, обладает антагонистическими свойствами против патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae, против стафилококков и грибов p. Candida.

Понятие о дисбактериозе, его классификация, проявления и методы лечения.

Дисбактериоз (дисбиоз) – это состояние, развивающееся в результате утраты нормальных функций микрофлоры. При этом происходит нарушение сложившегося равновесия между видами микробов, а также между ними и организмом человека, т.е. нарушается состояние эубиоза. При дисбактериозе происходят качественные и количественные изменения бактериальной микрофлоры. При дисбиозе – изменения и среди других микроорганизмов (вирусов, грибов). Дисбактериозы вызывают различные эндогенные (внутренние) и экзогенные (внешние) факторы. Чаще всего развиваются дисбактериозы кишечника.

Вид дисбактериоза по возбудителю:

• 
  стафилококковый
• 
  протейный
• 
  дрожжевой
• 
  ассоциированный (стафилококковый, протейный, дрожжевой)

• 
  компенсированная - клинических проявлений может не быть;
• 
  субкомпенсированная - проявления дисбактериоза иногда возникают при диетических нарушениях, например;
• 
  декомпенсированная - приспособительные механизмы истощены, вылечить дисбактериоз трудно.